منوی کاربری

 تبلیغات

hamid
همکار


پست ها : 70
محل سکونت :
عضویت در : 02 آذر 1391
Site | Yahoo | Email
Real Time PCR
ارسال شده توسط hamid در 19 آبان 1392 ساعت 21:41

مقدمه
Real time PCR نسبت به سایر روش‌های متداول PCR مزایایی دارد که مهمترین آن‌ها شامل:
· میزان محصول در هر چرخه قابل ردیابی است در حالی که محصول روش‌های سنتی پس از پایان واکنش و الکتروفورز مشخص می‌شود.
· امکان بررسی و آنالیز چند رونوشت متفاوت در یک تیوپ امکان پذیر است.
· حساسیت و دامنۀ دینامیکی آن 1000 برابر RT- PCR سنتی است؛
· به کمک این تکنیک می‌توان ارزش گذاری کمی انجام داده و میزان الگوی اولیه را دقیقاً تخمین زد.
اما در کنار این مزایا می‌توان به ناتوانی این تکنیک در برآورد اندازۀ محصول تکثیر شده وپرهزینه بودن آن اشاره کرد. برای آشنایی بیشتر با این تکنیک بهتر است که برخی واژه‌های پر کاربرد آن را مرور نماییم (جدول 1).

جدول 1 اصطلاحات متداول در Real time PCR
Amplification plot
یا نمودار تکثیر، نموداری است که در آن تعداد چرخه‌ها در مقابل شدت نور فلورسنت رسم می‌شود.
Baseline
یا خط پایه به چرخه‌های ابتدایی گویند که در آن‌ها شدت نور فلورسنت تغییر معنی‌داری نکرده است
CT number
یا چرخۀ آستانه به اولین چرخه‌هایی گویند که شدت نور فلورسنت در آن‌ها به صورت معنی‌داری بیشتر از خط پایه است.
Normalization
نرمال سازی عبارت است از بکار بردن یک استاندارد بی‌اثر و بدون تغییر در واکنش تا به کمک آن بتوان خطاهای مراحل آزمایش را کم کرده یا از بین برد.
Passive reference
رفرانس بی‌اثر یک رنگ برای نرمال سازی به شمار می‌آید. معمولاً از رنگ ROX برای حذف نوسانات تابش و دریافت نور در لوله‌های متفاوت PCR استفاده می‌شود.
Standard curve
نمودار استاندارد، تعداد CT در مقابل لگاریتم غلظت یک نمونه استاندارد را نمایش می‌دهد و از این نمودار برای تخمین غلظت نمونه‌های مجهول استفاده می‌شود.


2- اصول کار Real time PCR
همانگونه که گفته شد تمامی اصول و واکنش‌گرهایی که برای یک RT- PCR معمولی نیاز است در Real time هم بکار می‌رود اما یک گزارشگر فلورسنت نیز در واکنش حضور دارد این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر محصول نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. معمولاً اگر واکنش خود را بهینه کرده باشید در 3 تا 15 چرخۀ ابتدایی تغییر چندانی در شدت فلورسنت نمی‌بینید و که به این منطقه خط پایه گویند (شکل 1).


در ادامه شدت فلورسنت رو به افزایش می‌گذارد. به اولین چرخه‌هایی که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی‌دار دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. هر چه مقدار الگوی اولیه بیشتر باشد مقدار CT کم می‌شود. اگر بخواهیم با کمک این تکنیک یک برآورد کمی از مقدار الگوی اولیه داشته باشیم باید یک نمودار استاندارد رسم کنیم. بدین منظور غلظت‌های مشخصی از یک نمونه معلوم تهیه کرده و با دستگاه تکثیر می‌کنیم. سپس منحنی استاندارد رسم می‌شود (شکل 2). با تکثیر و ارزیابی CT برای نمونۀ مجهول می‌توان غلظت رونوشت اولیۀ آن را بدست آورد.




3- روش‌های شناسایی در Real time PCR
در سالیان اخیر پیشرفت‌های تکنیکی و ابزار زیادی در این علم اتفاق افتاده که مهمترین آن شاید اختراع دستگاه‌های چند کاناله باشد. این دستگاه‌ها قادرند به صورت همزمان چندین طول موج نوری متفاوت را تابانیده و بازتابش آن را ثبت نمایند. به عنوان مثال دستگاه Chromo 4™ از شرکت MJ Research چهار کاناله است و از امواج (490- 450؛ 535-500؛ 580-555؛ 650-620 نانومتر) برای تحریک فلورسنس استفاده می‌کند و سپس طول موج‌های (530- 515؛ 580-560؛ 650-610؛ 730-670 نانومتر) را به صورت همزمان و جداگانه برای 96 تیوپ آزمایش ثبت می‌کند.
تمامی دستگاه‌های مورد استفاده از دو تکنیک برای شناسایی نور استفاده می‌کنند.

3-1 رنگهای فلورسنت
شاید متداولترین رنگ مورد استفاده در Real time سایبرگرین I باشد. این رنگ اینترکاله و فلورسنت به شیارهای کوچک DNA دورشته‌ای متصل می‌شود و با جذب طول موج 498 نانومتر، نور 522 نانومتری را ساطع می‌کند که توسط دستگاه ثبت می‌شود. سایبرگرین I به الگوهای تک رشته‌ای متصل نمی‌شود لذا در این موارد بازتاب ضعیفی دارد.


شکل 3 این شکل نحوۀ عملکرد سایبرگرین I را نشان می‌دهد. همانگونه که دیده می‌شود این رنگ فقط هنگامی که بین دو رشته DNA قرار گیرد بازتابش فلورسنت دارد. لذا بازتابش فلورسنت در مراحل جفت شدن و گسترش قابل ثبت است و در مرحله دناتوره شدن شدت نور کم می‌شود. زمان ثبت این بازتابش در دستگاه قابل برنامه ریزی است.


سایبرگرین I یک رنگ غیر اختصاصی است لذا برای تمامی آزمایشات قابل استفاده است و این مسئله یک مزیت به شمار می‌آید. از دیگر مزایای این رنگ می‌توان به ارزانی، عدم تداخل با پلیمرازها، ساده و غیر سمی بودن آن اشاره کرد. همانگونه که گفتیم این رنگ غیر اختصاصی است و این مزیت، مهمترین عیب آن را نیز شامل می‌شود چرا که نمی‌توان وجود محصولات غیر اختصاصی یا پرایمر دیمر را به کمک این رنگ شناسایی کرد. البته استفاده از نمودار منحنی ذوب در دستگاه‌های امروزی این مشکل را تا حدودی مرتفع کرده است. اگر مخلوط DNA دو رشته‌ای در حضور سایبرگرین I به دمای ذوب خود نزدیک شود کاهش شدیدی در میزان فلورسنس توسط دستگاه ثبت می‌شود. با مقایسۀ نقطۀ ذوب محصول مورد انتظارتان با این نتایج تا حدودی می‌توان در مورد صحت کار پیش گویی نمود. مشکل عمدۀ دیگر سایبرگرین شدت بازتابش این رنگ است. هر چه طول قطعۀ محصول زیاد می‌شود تعداد رنگ به دام افتاده و همچنین شدت بازتابش نور زیاد می‌شود که اندازه‌گیری دستگاه را با اشکال مواجه می‌نماید. لذا توصیه می‌شود پرایمرهایی طراحی کنید که یک آمپلیکون 200 تا 300 تایی بدست آید.

3-2 پروب‌های فلورسنت
پروب‌ها بر خلاف سایبرگرین I بر اساس تشخیص اختصاصی توالی محصول کار می‌کنند. پروب‌ها معمولاً یک رنگ فلورسنس‌زا (Fluorogenic) و یک رنگ خاموش کننده (Quencher) دارند. معمولاً دستگاه‌ها رنگ فلورنس‌زا را تحریک می‌کنند و بازتابش آن را بررسی می‌نمایند حضور خاموش کننده در نزدیکی موقعیت فلورسنس‌زا موجب جذب نور آن و خاموش شدن آن می‌شود لذا در این حالت بازتابشی در دستگاه ثبت نمی‌شود.

3-2-1 پروب‌های TaqMan
روش سنجش TaqMan در سال 1996 به چاپ رسید. این روش بر دو حقیقت استوار است اول آن که از یک DNA پلیمراز با ویژگی اگزونوکلئازی ‘3’®5 استفاده شود و دیگر این که پروب‌ اولیگونوکلئوتیدی حاوی دو نشان رنگی (یکی فلورسنس‌زا و دیگری خاموش کننده) است و تنها زمانی سیگنال می‌دهد که با فعالیت اگزونوکلئازی شکسته شود. پروب مورد نظر از طریق توالی اختصاصی به محصولات متصل می‌شود. فعالیت اگزونوکلئازی پلیمراز رنگ فلورسنس‌زا در انتهای ‘5 پروب را می‌شکند. بدین وسیله گزارشگر فلورسنت از رنگ خاموش کننده مجاورش آزاد می‌شود و فلورسنس آن افزایش می‌یابد .



3-2-2 بی‌کون‌های مولکولی (Molecular beacons)
بی‌کون‌های مولکولی دارای دو بخش هستند: یک پروب که به طور اختصاصی با ژن هدف هیبرید می‌شود، یک ساقه که در حالت آزاد در محلول ساختار سنجاق سری تشکیل می‌دهد تا از نزدیک بودن کافی رنگ‌های فلورسنت‌زا و خاموش کننده به هم اطمینان حاصل شود. بی‌کون‌های مولکولی در مرحلۀ هیبریداسیون با ژن هدف جفت می‌شوند. افزایش فاصله دو رنگ موجب کاهش اثرات خاموش کنندگی و افزایش بازتابش نور می‌شود. مهمترین مزیت بی‌کون‌های مولکولی این است که در جریان واکنش دست نخورده باقی می‌مانند و در چرخه‌های بعدی مجدداً هیبرید می‌شوند. میزان تشعشع فلورسنس در مرحلۀ هیبریداسیون، با غلظت ژن هدف متناسب است.


3-2-3 اِسکورپیون‌ها (Scorpions)
شکل آزاد پروب‌های اِسکورپیون با بی‌کون مولکولی در محلول شباهت دارد و ساختار سنجاق سری تشکیل می‌دهند با این تفاوت که یکی از پرایمرهای تکثیری با اتصال کوالان به توالی پروب متصل شده است. بر خلاف بی‌کون‌های مولکولی، ساختار سنجاق سری اِسکورپیون به انتهای '5 پرایمر اختصاصی متصل می‌شود. بعد از مرحلۀ گسترش و در دور دوم دناتوره شدن، ساختار سنجاق سری باز می‌شود و به پروبی دارای توالی اختصاصی اجازه می‌دهد که به عقب خم شده و با توالی هدف در محصولPCR هیبرید شود. باز شدن حلقۀ سنجاق سر از خاموش شدن گزارشگر جلوگیری می‌کند و فلورسنس افزایش می‌یابد.


4 آنالیزهای کمی در Real time PCR
دو روش عمده برای بررسی کمی در Real time PCR وجود دارد که به شرح مختصر هر کدام می‌پردازیم.

4-1 روش منحنی استاندارد (مقایسۀ مطلق)
در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (nm260) تعیین می‌شود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل می‌شود (شکل 2). استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است هرچند که بسیار گران قیمتند.
برای حذف نوسانات مقادیر RNA وارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه‌ها و فرد از استانداردهای داخلی استفاده می‌شود. این استانداردها باید در همۀ بافت‌ها بیان ثابت داشته باشند و آزمایش ما نباید بیان آن را نسبت به نمونۀ کنترل تغییر دهد. بدین منظور از ژن بتا اکتین و GAPDH استفاده می‌شود. به این ژن‌ها Housekeeping گویند. علاوه بر برپایی PCR با پرایمر اختصاصی ژن برای هر نمونه یک PCR همزمان با پرایمر بتااکتین یا GAPDH هم انجام می‌شود و داده‌های هر نمونه با ژن Housekeeping همان نمونه نرمالایز می‌شود. سپس با استفاده از نمودار استاندارد می‌توان به غلظت نمونۀ مجهول پی برد.
4-2 روش آستانه نسبی (مقایسۀ نسبی)
در این روش نیازی به رسم منحنی استاندارد نیست. و مقدار نرمالایز شدۀ CT نسبت به یک نمونۀ تیمار نشده سنجیده می‌شود. در این روش نیز به استانداردهای داخلی نیازمندیم و باید مقدار CT آن‌ها از مقدار CT نمونۀ مورد نظر کسر گردد (نرمالایز کردن).
تفاوت نسبی نمونۀ آزمایش در مقابل کنترل با فرمول -ΔΔCT 2 محاسبه می‌شود.
ΔΔCT = ((ΔCT نمونه هدف) – (ΔCT کالیبره کننده)).
ΔCT عبارت است از CT ژن هدف (یا کالیبراتور) که از CT ژن خانه‌زاد کسر شده است.
طبق مقالۀ Pfaffle و همکارانش بهتر است برای هر تیمار سه تپوپ تهیه شود و هر آزمایش سه بار تکرار شود (9 داده برای هر تیمار) سپس میانگین آن را برای معادله بکار برد. به عنوان مثال اگر میانگین اختلاف CT یک تیمار با استاندارد داخلی 17 و میانگین اختلاف نمونۀ شاهد با استاندارد داخلیش 19 شود داریم.
2 -ΔΔCT = 2 – (17 – 19 ) = 2 2 = 4
این عدد بازگو می‌کند که تیمار ما موجب افزایش 4 برابری ساخت mRNA هدف شده است.
4-3 کارایی Real time PCR
قبل از اندازه‌گیری کمی باید کارایی PCR سنجیده شود. کیفیت و طراحی پرایمرها مهمترین عامل اثر گذار بر کارایی PCR است. علاوه بر آن نوع دستگاه، نوع کیت مصرفی، پروتکل آزمایش نیز بر کارایی PCR اثر می‌گذارند.
بدین منظور باید از ژن مورد مطالعۀ خود یک سریال دیلوشن بسازید (دانستن غلظت اولیه اهمیت ندارد) این سریال دیلوشن را Real time PCR کنید. کارایی دستگاه طبق معادلۀ پافل بین 90 تا 110 درصد و رگرسیون خط باید حداقل 0.95 شود. همین آزمایشات را برای استاندارد داخلی نیز تکرار کنید اعداد بدست آمده به هم نزدیک باشند و در رنج نرمال قرار بگیرند (به مقالۀ Pfaffl مراجعه کنید).



 آمار و اطلاعات
مدير کل سايت دستيار مدير  کاربر خاص  کاربر سايت


مباحث : 662 ، ارسال ها : 0 ، کاربران : 48 ، تالار ها : 100 موضوعات : 45

تعداد مطالب سايت : 53 ، بازديد امروز : 370 ، بازديد ديروز : 313 ، بازديد کل : 132120
کاربران آنلاين : 0 ، ميهمان هاي آنلاين : 55